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荧光定量PCR生物实验常见的问题解答!

  在荧光定量PCR生物实验中,我们肯定能够遇到各种各样的问题。96孔板哪家好?制作了两天的标准曲线,线性关系确定,R平方为0.998。但是,放大效率仅为80%,并且放大曲线不太平滑。SYBR作为荧光染料,样品的荧光强度也很低,仅为100-200。答:曲线不平滑,有时与染料量有关,可以增加外观,或者放大产物太少。
 

96孔板哪家好

  1. PCR反应效率低:引物,试剂和PCR条件的原因。

  进行实时pcr优化系统很重要,并且放大效率很低。您可以增加镁离子的浓度。如果其他条件良好,它将无法正常工作。这就是引物的原因。然后,您只能重新设计引物。

  2.在反应中混合会影响反应的物质:

  模板提取方法有待改进

  3.样品稀释不准确:

  这个非常重要。当标准曲线非常差时,其中许多倍就是稀释问题。在正常条件下,该比例为稀释前后的10.32个循环。

  问:实时PCR的敏感性

  答:对于染料方法的荧光定量,Ct值在13到30之间相对准确,需要在30到33之间重新确认,并且在上述范围内的置信度相对较差。

  问:标准曲线是否重复了两次或三次?96孔板怎么使用?

  答:没有人说定量PCR的标准曲线应重复两次或三遍,但用于制作标准曲线的梯度点不得少于四个,否则标准曲线的准确性不高。

  问:关于荧光定量标准曲线的制作

  答:虽然通用仪器声称能够执行单拷贝检测,但是如果它不是专门设计的系统,则很难准确定量100份或更少。通常,标准曲线的Z小浓度为1000份,从而降低了可靠性。它减少了,这不是稀释或其他问题,但是您选择的标准曲线的浓度优选不小于1000份。如果降低它,则几乎不能接受100份,否则,即使您将其认可也不会太高。

  问:溶出曲线高怎么回事?

  答:Tm值相同,并且峰高的差异在表达丰度上也不同。相同的扩增产物在Tm值上的差异也可能很小,一般差异在1度以内是可以接受的。熔解曲线的纵坐标表示荧光信号相对于温度的一阶负导数。

  问:定量PCR没有扩增什么情况?96孔板怎么样?

  答:运行定量PCR产物的电泳,看是否有任何产物。如果电泳中有条带,则说明PCR成功,但未读取荧光信号。在这种情况下,请调整染料或探针的浓度(请参见)。无论是染料法还是探针法)如果电泳中没有条带,则应在定量PCR仪上优化实验条件。尽管您已经优化了普通PCR仪上的条件,但是如果您更改定量PCR仪,由于两种仪器的温升和温度精度不同,也可以在没有相同条件的情况下进行PCR。

  由于许多因素,扩增子的溶解温度将变化。溶解温度受特定缓冲液的pH,Taq聚合酶,SG和MgCl2浓度以及其他因素的影响。要比较溶出曲线,首先需要确保使用的条件相同。

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